ECHO在DNA組裝中的應(yīng)用
 
 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亞基ɑ（PIK3CA）是一個(gè)被廣泛研究的基因， 鑒于PIK3CA在癌癥研究中的重要性，我們將以它為例來(lái)展示Echo 525系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的微量化NEBuilder HiFi試劑盒應(yīng)用。根據(jù)目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，PIK3CA被拆分為四個(gè)模塊化片段7，并帶上C末端GLP標(biāo)簽。在模塊化片段中設(shè)計(jì)了四個(gè)已知的致癌突變 —— R38H、 E542K、E545K和H1047R，同時(shí)我們也設(shè)計(jì)了一個(gè)野生型對(duì)照。（如下圖）。
 
 DNA組裝
 為更真實(shí)地模擬實(shí)際應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)，我們對(duì)該微量化反應(yīng)體積的模塊化DNA組裝進(jìn)行了構(gòu)建設(shè)計(jì)。選擇PIK3CA 癌基因，并根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃樗膫€(gè)片段。這些片段或?yàn)橐吧托蛄谢蚝幸阎掳┩蛔僐38H、E542K、E545K和H1047R。這些片段將**入線性化的 pcDNA?3.1/Zeo (+) 哺乳細(xì)胞載體中。該Kpnl-HF酶切的載體被稱為片段 5。所有片段從IDT公司定制（gBIocks®基因片段），其末端均帶有 23-25 個(gè)堿基對(duì)的重疊區(qū)。隨后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增載體和gBIocks，以獲得實(shí)驗(yàn)所需用量。在進(jìn)行了載體DNA組件生產(chǎn)（pcDNA?3.1/Zeo (+) 片段5）后進(jìn)行DNA純化、定量分析和電泳觀察（片段1-5）。
 DNA和NEBuilder HiFi
 Master Mix 陣列
 使用Agilent 2200 TapeStation 分析DNA 濃度，并將DNA稀釋至組裝所需濃度。然后，將稀釋好的DNA轉(zhuǎn)移至經(jīng)Echo驗(yàn)證過(guò)的低死體積384微孔板（384 LDV Plus）。另外將NEBuilder HiFi 2x Master Mix 分裝入384 LDV Plus板。對(duì)于復(fù)雜組裝，NEBuilder HiFi 試劑盒的建議組裝體積為 20 uL，每個(gè)片段的加入量為 0.5 pmol。根據(jù)以往echo結(jié)果， 500 nL 反應(yīng)體系（每個(gè)片段1.25 fmol）具有高穩(wěn)定性。按照該條件完成體系構(gòu)建和封膜后，于Applied Biosystems ProFlex PCR 50°C孵育1小時(shí)。待PCR反應(yīng)板冷卻至4°C后轉(zhuǎn)化到 NEB 10B 大腸桿菌細(xì)胞中。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化/質(zhì)粒構(gòu)建，大腸桿菌鋪板。
 
 gBLOCK® 擴(kuò)增引物
 模塊化 DNA 組裝所使用的試劑體積。這些試劑全部通過(guò) Echo 525 從 384 LDV Plus 板上進(jìn)行移液。
 菌落qPCR質(zhì)控
 針對(duì)組裝質(zhì)粒構(gòu)建物的4個(gè)不同連接區(qū)，Echo 525 移液器可**地將 250 nL 的細(xì)胞懸液分滴至4個(gè)10 uL qPCR反應(yīng)體系中，作為質(zhì)粒組裝的一種質(zhì)控方式。對(duì)于4種反應(yīng)，分別配制含有擴(kuò)增子引物對(duì)和 LightCycler® 480 SYBR Green I Maser 核酸染料的qPCR反應(yīng)母液。首先將母液分裝到帶條形碼的 Bio-Rad Hard-Shell* Skirted 384孔PCR 板中，1000 x g離心1分鐘。隨后，采用P10槍頭挑選單克隆到Echo Qualified 384 孔聚丙烯微孔板 2.0 （384孔PP板）中，接種在 50 uL diH20。對(duì)裝有細(xì)胞的384孔 PP 板封膜，置于Eppendorf MixMate® 2000 RPM 2分鐘渦旋震蕩。從該混合物中，使用Echo校準(zhǔn) 384PP_AQ_BP，將 250 nL 的細(xì)胞懸液噴射到384孔PCR 板的相應(yīng)qPCR反應(yīng)母液中。然后，光學(xué)薄膜密封qPCR板， 2000 RPM渦旋震蕩2分鐘， 1000 x g 離心1分鐘。接下來(lái)，根據(jù)表7中實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行菌落qPCR檢測(cè)。同時(shí)具有3個(gè)連接取qPCR cp值（與氨芐青霉素對(duì)照匹配）的菌落被認(rèn)為是陽(yáng)性組裝物，將對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序。
 菌落qPCR反應(yīng)體積
 相關(guān)貝克曼庫(kù)爾特MET ONE HHPC3+ 手持式顆粒計(jì)數(shù)器介紹：http://www.ojtmg.cn/cewenyi_Product_2048153535.html
 
 利用更小規(guī)模的DNA組裝方法能夠減少合成生物學(xué)研究成本，加速實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建、測(cè)試的過(guò)程。在本次實(shí)驗(yàn)中，NEBuilder HiFi利用ECHO 525每次移液25納升進(jìn)行致癌基因的五個(gè)模塊片段的組裝。與NEBuilder HiFi試劑盒的建議量相比，使用ECHO 525進(jìn)行組裝減小了40倍的反應(yīng)體系。按照40倍減少的反應(yīng)計(jì)算，500納升的反應(yīng)體系只需要1.25fmol DNA。我們可以看到，使用ECHO 525能夠以低成本的反應(yīng)體系獲得高質(zhì)量的DNA構(gòu)建，減少DNA組裝成本，擴(kuò)展了基因工程的方法，為科學(xué)家探索更廣泛的生物學(xué)領(lǐng)域助力。